cDNA文库必须满足什么条件?其构建包括哪些步骤?

条件：1

、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA。

2

、要进一步获得cDNA全长

3

、加适当接头，连接到适当的载体内。

4

、转化受体细胞，构建为cDNA文库。

基本步骤包括：RNA

的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA

文库，获得高质量的mRNA

是至关重要的，所以处理mRNA

样品时必须仔细小心。由于RNA

酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA

酶的环境对于制备优质RNA很重要。在获得高质量的mRNA

后用反转录酶Oligo(dT)

引导下合成cDNA

第1链，cDNA

第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA

聚合酶I，同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断。扩增cDNA

文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ

噬菌体，这是因为λ

DNA

两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。

标签：cDNA,文库